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Jeason

1583字约5分钟

2024-04-16

这是一个经典的单细胞分析流程，主要分为以下几个步骤：

实验设计

在正式分析之前，关于实验问题的探讨是很有必要的，最重要的一个就是技术的选择：

  • Droplet-based: 10X Genomics, inDrop, Drop-seq
  • Plate-based with unique molecular identifiers (UMIs): CEL-seq, MARS-seq
  • Plate-based with reads: Smart-seq2
  • Other: sci-RNA-seq, Seq-Well

每种方法都有优劣（Mereu et al. 2019; Ziegenhain et al. 2017)，目前以10X为代表的droplet-based方法由于高通量和低细胞成本成为了约定俗成的技术；Plate-based方法可以捕获其他的一些表型信息（如细胞形态），另外可以根据实验目的进行调整，灵活性比较好；Read-based方法可以覆盖全转录本，在分析可变剪切、外显子突变等方面很有用；UMI-based方法可以减轻PCR扩增偏差。

下一个问题就是：到底要捕获多少细胞？测序要测多深？

答案很清晰： As much as you can afford to spend.

再补充一下这个答案就是：想要发现罕见细胞类群，就要多获得细胞；想要探索潜在的微小差异，就要加大测序深度。目前常用的droplet-based仪器可以捕获1万到10万细胞，测序深度是每个细胞1000到10000 UMIs，在经济条件一定的前提下，它们之间一般是成反比。另外它还要权衡高细胞捕获通量和影响捕获效率的“双细胞比例”。

实验设计和常规转录组类似，也是要考虑一个实验条件下多个生物重复，而且实验条件最好不要混杂批次。需要注意的是：生物重复不是指的单个细胞，而是指的提供细胞的供体（donors）或者细胞培养体系（cultures）

获得表达矩阵

和常规转录组一样，单细胞转录组也是需要得到表达矩阵，才能进行下游分析。表达矩阵包含的信息就是：每个细胞中比对到每个基因的UMIs或者reads数。有一点需要注意：它的定量方法和具体的实验技术相关

  • 10X的数据：使用 CellRanger 软件，基于STAR比对到参考基因组，然后统计每个基因的UMIs数量
  • Pseudo-alignment方法（如 alevin）：不需要比对参考基因组，节省时间、内存
  • 对于一些高度multiplexed的方法：可以使用 scPipe 包：提供了一套综合的分析流程，利用 Rsubread比对，然后统计每个基因的UMIs数量
  • CEL-seq、CEL-seq2数据：scruff 包可以专门分析
  • read-based方法：可以使用常规bulk 转录组定量的流程（比如smartseq2就可以用hisat2+featureCounts）
  • 任何包含spike-in转录本的数据：spike-in序列都要在比对、定量之前加到参考基因组中

multiplexed：翻译叫做”多路复用“，即：large numbers of libraries to be pooled and sequenced simultaneously during a single run，可以节省成本和时间

定量结束后，一般是先导入表达矩阵然后创建一个 SingleCellExperiment对象（例如：read.table() + SingleCellExperiment()）。除此以外，还有一些特定的文件格式需要用特定的包，比如DropletUtils可以分析10X数据，tximport/tximeta 可以分析pseudo-alignment数据

需要注意的点：

  • 一些定量工具会统计表达矩阵中的reads比对率，会存在一些未必对的情况。尽管这些信息可以用作质控，但这些数值如果被误认为是表达量信息，那么就会干扰下游分析。因此在进行下游分析之前，这部分信息可以去掉或者保存在 colData中
  • 如果分析的是人类数据并且加入了ERCC，我们很多时候直接用 ^ERCC在行名中进行正则匹配，但是这时要小心，因为ERCC基因家族在人类基因组注释中确实存在，很有可能将真的基因作为外源转录本进行分析。这个问题可以通过将表达矩阵的行名设置为Ensembl,或Entrez来解决

数据处理与下游分析

  1. quality control：去掉低质量细胞。这些细胞可能在建库环节被破坏，可能没有被有效捕获（这就是所谓的“dropout”）。一般会统计：每个细胞的全部count数、spike-in或线粒体reads比例、检测到基因的数量
  2. normalized expression value：为了减小细胞文库的偏差（可能由于细胞捕获效率不同、测序深度的差异而造成文库大小差异），把细胞们放在同一起跑线上，才能进行下面的细胞相似性比较，后面再根据相似性进行细胞分群。一般是基于log转换（当然有的函数也涉及了一些size factor的计算），从而对均值-方差进行校正
  3. feature selection：一般选取高变异基因（Highly Variable Genes）进行后续分析，使用HVGs不用全部基因的原因一是为了减少计算量，二是减少不感兴趣基因（比如在细胞之间没什么差异）对分析产生的噪音
  4. dimensionality reduction：让数据更“紧凑”，一般是线性降维PCA+非线性降维tSNE/umap。PCA一般是先获得初步的低维数据（可能会挑出几十个主成分），然后传给t-SNE进一步压缩，进行可视化
  5. clustering：根据细胞归一化后的表达量相似性分成组，然后根据每个组marker基因（可理解为这一群细胞的标志性基因）的差异表达对分群进行生物学定义

演示

用 scRNAseq包的droplet-based的视网膜数据【Macosko et al. (2015)】进行演示。

library(scRNAseq)
sce <- MacoskoRetinaData()

# Quality control.
library(scater)
is.mito <- grepl("^MT-", rownames(sce))
qcstats <- perCellQCMetrics(sce, subsets=list(Mito=is.mito))
filtered <- quickPerCellQC(qcstats, percent_subsets="subsets_Mito_percent")
sce <- sce[, !filtered$discard]

# Normalization.
sce <- logNormCounts(sce)

# Feature selection.
library(scran)
dec <- modelGeneVar(sce)
hvg <- getTopHVGs(dec, prop=0.1)

# Dimensionality reduction.
set.seed(1234)
sce <- runPCA(sce, ncomponents=25, subset_row=hvg)
sce <- runUMAP(sce, dimred = 'PCA', external_neighbors=TRUE)

# Clustering.
g <- buildSNNGraph(sce, use.dimred = 'PCA')
colLabels(sce) <- factor(igraph::cluster_louvain(g)$membership)

# Visualization.
plotUMAP(sce, colour_by="label")

Reference

Orchestrating Single-Cell Analysis with Bioconductor