Cell Ranger使用基础

Jeason

1883字约6分钟

2024-10-05

背景

Cell Ranger是由10x Genomics公司提供的一套用于处理单细胞RNA测序数据的工具。官网对其进行了详细的介绍和使用说明。可以通过10x Genomics Cloud Analysis使用这个软件或者将其安装到本地。

10X genomics 测序原理

10X简单原理

一个油滴（GEM） = 一个单细胞 + 一个凝胶微珠 = 一次scRNA-seq

一个单细胞文库包含的微观信息如下：

对于V2试剂盒构建的序列结构如下:

对于V3试剂盒构建的序列结构如下:

Barcode: 用来标记细胞
UMI (Unique Molecular Identifier): 用来标记转录本
PolyT: 用来捕获成熟的RNA

cell ranger 安装

CellRanger必须在Linux系统下运行。首先去下载Linux版本对应的软件安装包，下载之前需要提交信息登陆10x Genomics。然后登录自己的服务器并使用mkdir 和cd等命令建立并进入到软件安装目录。使用下面的命令下载软件:

## 使用 curl
curl -o cellranger-8.0.1.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-8.0.1.tar.gz?Expires=1728179900&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA&Signature=CJ5UER4VwoTgNMsuTsI9Bvv7Y5z0mjcGSDWIxun93bB-NlBZxr8C-vLaUyNfotsFTS3coAllmkcjnhW8rb9EAmA1oLFrNzaoPNmtff3DM1qk02cpdPbiChwXRW6c4NZ1Aw6YEiMoI4-KaYCCz6vrNhZ1NeKoFrM8RthKS5Br8-izW3i3RLdJsxyXW8BjOzKWtWH7rB7J2Mhg~MKez9-XJqMsmYDpSTBam1zFq42x5JMNrcMIuzZAzxunCFFZOPTlLO9RetLNPi2TcldZn2jsl8yuhQPXHqDhyBhysbDIAYodP8EyylYt0lNkuGuigVpqo0e1yyl1aqFG~9VnkExIcQ__"
## 使用 wget 或axel 等
wget -O cellranger-8.0.1.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-8.0.1.tar.gz?Expires=1728179900&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA&Signature=CJ5UER4VwoTgNMsuTsI9Bvv7Y5z0mjcGSDWIxun93bB-NlBZxr8C-vLaUyNfotsFTS3coAllmkcjnhW8rb9EAmA1oLFrNzaoPNmtff3DM1qk02cpdPbiChwXRW6c4NZ1Aw6YEiMoI4-KaYCCz6vrNhZ1NeKoFrM8RthKS5Br8-izW3i3RLdJsxyXW8BjOzKWtWH7rB7J2Mhg~MKez9-XJqMsmYDpSTBam1zFq42x5JMNrcMIuzZAzxunCFFZOPTlLO9RetLNPi2TcldZn2jsl8yuhQPXHqDhyBhysbDIAYodP8EyylYt0lNkuGuigVpqo0e1yyl1aqFG~9VnkExIcQ__"

下载完成后解压文件：

tar -xzvf cellranger-x.y.z.tar.gz

将cellrange文件添加到环境变量中，即可正常使用cellranger

export PATH="/path/to/cellrange:$PATH"

cellranger -V
# cellranger cellranger-7.2.0

使用命令

cellranger提供了五个分析模块用于分析单细胞转录组数据

cellranger mkfastq

该命令封装了illumina的bcl2fastq软件，用来拆分illumina测序仪得到的BCL(raw base call)格式文件，输出fastq文件。

使用方法

## 两种使用方法
cellranger mkfastq --id=tiny-bcl \
--run=/path/to/tiny_bcl \
--csv=cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv

cellranger mkfastq --id=tiny-bcl \
--run=/path/to/tiny_bcl \
--csv=cellranger-tiny-bcl-simplesheet-1.2.0.csv

如果使用第一种，则cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv需要包含以下信息：

Lane,Sample,Index
1,test_sample,SI-P03-C9

Lane: 指定所在lane ID
Sample: 样本名称(来源于哪个GEM well，一般是一份生物样品，一个GEM well对应一个library，可以理解为下图芯片中的一个channel)
Index: 指定index的名称，10X genomics的每个index代表4条具体的oligo序列

具体情况可以根据如下的测序芯片去理解。

根据建库的不同可以分为如下操作：

两个不同的文库（或者说sample）在同一个flowcell上上机测序，执行一次cellranger mkfastq，得到不同样本的数据
一个文库分两次或多次上机，需要根据上机的不同分别执行cellranger mkfastq

如果使用第二种方法，需要准备的信息就多一些(如下图所示)，比如调整Reads中的序列长度，而使用简化版的csv文件，cell ranger可以识别所用试剂盒版本，然后自动化的调整reads长度。

参数说明

--run 必选；BCL文件所在目录
--id 可选；mkfastq将会生成相应目录，不接受绝对路径
--samplesheet 可选. 样本名字、index等信息；
--output-dir 指定FASTQ输出目录
--localcores 运行的最大CPU数
--localmem 运行的最大内存数

cellranger count

分析cellranger mkfastq或者其他方式得到fastq格式的文件。这个模块包括比对、过滤、barcoding计数以及UMI计数。可以生成barcode-UMI信息，进行聚类及基因表达分析。不过我们通常用到表达信息，使用其他方式进行聚类及其他单细胞相关分析。

在分析count之前需要先下载参考基因组

可以直接从10x Genmoics官网下载已经构建好的参考数据

curl -O "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz" # 人
curl -O "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCm39-2024-A.tar.gz" # 小鼠

或使用cellranger mkref自己构建参考基因组

cellranger count --id=sample345 \
--transcriptome=/path/to/refdata-gex-GRCh38-2020-A \
--fastqs=/path/to/fastq \
--sample=mysample \
--localcores=8 \
--localmem=64

输出结果包括以下信息：

Outputs:
- Run summary HTML:                 /outdir/outs/web_summary.html
- Run summary CSV:                  /opt/sample345/outs/metrics_summary.csv
- BAM:                              /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam
- BAM index:                        /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam.bai
- Filtered feature-barcode matrices MEX: /opt/sample345/outs/filtered_feature_bc_matrix
- Filtered feature-barcode matrices HDF5: /opt/sample345/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5
......